Il Museo Diocesano nasce come emanazione della Diocesi ambrosiana, della quale esprime il riflesso nell'arte e soprattutto l'identità storica ed ecclesiale. Conserva e promuove i preziosi beni artistici della Diocesi, valorizzandone il significato storico e religioso: l'incontro con la bellezza delle opere d'arte assume in questo contesto un'importanza nuova e densa di significato.
La prima idea per il Museo Diocesano risale al 1931, quando il Beato Ildefonso Schuster, arcivescovo di Milano, indirizza al clero una lettera intitolata Per l'arte sacra e per un museo diocesano, in cui incoraggia la nascita di un'istituzione specificamente dedicata a promuovere e raffinare l'amore per l'arte presso "le persone a Dio dedicate" e al tempo stesso volta ad impedire la dilapidazione del cospicuo patrimonio artistico della Diocesi. Il suggerimento fu accolto solamente nel 1960 quando il Card. Giovan Battista Montini stipula un accordo fra la Curia e il Comune di Milano in cui si prevede la ristrutturazione, a spese dell'Opera Diocesana per la preservazione e la diffusione della fede, dei Chiostri di Sant'Eustorgio, indicati come sede del nuovo Museo. Di fatto questa convenzione non viene ratificata e le iniziative rimangono sospese fino agli anni Ottanta: solo allora il Card. Carlo Maria Martini avvia il progetto di ricostruzione e riadattamento dei chiostri, affidato allo studio dell'architetto Lodovico Barbiano di Belgiojoso.
Il nuovo Museo è stato inaugurato il 5 novembre 2001.